Coloration des mycorhizes
B7 - Observation de mycorhizes - extrait de l'article de Alix Helme -Guizon et Marc André Selosse (cf. § ressources)
Résumé
Ce protocole permet visualiser les filaments mycorhiziens en symbiose avec les plantes supérieures.
Question posée
Est-ce que mon sol contient des champignons mycorhiziens ?
Principe
Il s’agit de décolorer toutes les cellules en conservant leurs parois, puis de colorer les parois des cellules du champignon grâce à un colorant de la callose, un glucane majeur de celles-ci. Les champignons concernés sont des Eumycètes du groupe des Gloméromycètes ou Glomales.
Matériels et fournitures
une plante quelconque, excepté une Brassicacée ou une Chénopodiacée (groupes non-symbiotiques, avec des poils absorbants seulement). Avec une Fabacée, on observera aussi des nodosités. Nous avons aussi eu de bons résultats avec du Pâturin, et d’excellents avec du Plantain et une racine drageonnante (superficielle) de Merisier. Eviter surtout les sols très riches, où les plantes se nourrissent seules, sans plus établir de mycorhizes. Garder les racines les plus fines qui sont les plus mycorhizées : pour cela, éviter de tirer les racines ou d’arracher les plantes du sol, il vaut mieux extraire une motte puis dégager les racines sous l’eau ;
du bleu coton : bleu de méthyle (Color Index 42780) 1 % et acide acétique 3 % ;
de la potasse KOH 10 % ;
un tamis ou micropline pour récupération et rinçage ;
de l’eau acidifiée : eau distillée + un peu d’acide chlorhydrique très dilué.
Protocole
Laver précautionneusement les racines et prendre les plus jeunes, les couper à une longueur de 1-2 cm
Les mettre dans un tube à essai avec la potasse 10 %, et chauffer au bain-marie 90° C durant 30 min (on peut optimiser ce temps, parfois 10-15 min suffisent si l’on est pressé et/ou si les racines sont fragiles). Cette opération détruit le contenu des cellules végétales et décolore les tanins des racines ligneuses. La solution devient alors brun-rouge.
Jeter la potasse et filtrer dans un tamis, rincer avec l’eau acidifiée pour neutraliser.
Pour une observation directe, monter dans l’eau. Si on souhaite observer plus tard ou conserver les lames, monter dans le lactoglycérol. Si c’est trop épais, écraser doucement avec le dos d’un crayon papier en bois, voire donner un coup sec avec une gomme carrée (pour ne pas casser la lamelle). Si on souhaite conserver la préparation plusieurs années, mettre une pince à linge sur la lamelle et du vernis à ongles transparent tout autour de la lamelle (le lactoglycérol est un peu miscible avec le vernis). Le lendemain déplacer la pince à linge et remettre une couche de vernis. L’un de nous a conservé des lames 15 ans avec cette technique !
Observations
Le bleu coton marque le champignon mycorhizien, présent dans tout le parenchyme cortical, sans jamais entrer dans le cylindre central. On distingue des arbuscules à l’intérieur de certaines cellules racinaires (structure d’échange entre partenaires) et des vésicules entre les cellules (souvent, une goutte lipidique dedans : c’est une structure de réserve pour le champignon). On voit parfois aussi des hyphes externes, qui ne sont jamais cloisonnés. Il s’agit donc d’une endomycorhize à arbuscules. Si les arbuscules paraissent nuageux (à la limite, une vague couleur bleue dans la cellule), c’est qu’ils sont trop lysés : diminuer le temps de décoloration. Une coloration directe peut être essayée sur les racines très claires.
Pour aller plus loin
Coloration des ectomycorhizes (sur racines d'arbres)
Bien qu’elles ne concernent que les arbres des régions tempérées (et de quelques forêts tropicales), les ectomycorhizes formées par des Ascomycètes et, le plus souvent, des Basidiomycètes, peuvent être montrées car elles sont faciles à observer à l’oeil nu ou à faible grossissement. Pour cela, prélever en saison de végétation de préférence, et en sol pas trop riche, des petits chênes, sans tirer la racine (avec la motte), qui ont eu le temps de développer de belles racines dans un sol meuble. On peut aussi chercher dans l’humus épais sous des Pins ou des Hêtres : là, dans les accumulations de matière organique, les mycorhizes se dissocient bien du sol. Elles sont souvent placées latéralement sur une racine traçante, à croissance continue, et sont rendues visibles par leur couleur différente (celle du champignon) et/ou leur aspect cotonneux (hyphes du champignon ; figure 3a). Souvent, leur forme est modifiée : elles sont très ramifiées (fig. 3b), voire dichotomiques sur le Pin (fig. 3c) ; il faut y voir l’effet d’analogues d’auxines produits par le champignon qui, en stimulant la rhizogenèse, démultiplie les sites d’interaction avec son hôte. L’analyse peut se faire à l’oeil nu sur le terrain mais le mieux est de ramener les échantillons et de les regarder sous la loupe binoculaire, dans une coupelle d’eau pour éviter le séchage. La morphologie est la plus parlante – et très variable d’une espèce de champignon à l’autre (fig. 3). On peut, sous la loupe, récupérer des mycorhizes et tenter des coupes : effectuer des coupes transversales, complètes ou non (les coupes incomplètes montrent des biseaux dont la marge, très fine, révèle la structure cellulaire). On voit au moins le manteau d’hyphes fongiques autour de la racine. Mais avouons-le : sans coupe fine ni fort grossissement, il est difficile de voir le réseau de Hartig, c’est-à-dire les hyphes pénétrant entre les cellules racinaires corticales, et dont le rôle d’échange est analogue à celui des arbuscules.
On peut aussi écraser ou dilacérer une ectomycorhize afin de voir les hyphes. Pour l’écraser sans casser la lamelle : n’en mettez pas trop, écrasez en tapotant avec le dos d’un crayon papier en bois. Il est possible aussi de colorer des ectomycorhizes, mais ce n’est souvent pas nécessaire pour les plus frappantes. Couper les petites racines, ou reprendre les coupes, et les placer sur une lame. Colorer avec du rouge Ponceau à 0,1 % dans de l’acide acétique à 10 %. Si vous n’avez pas de rouge Ponceau, le bleu de toluidine (0,1 % dans du tampon acétate pH = 4,6) donne des résultats convenables mais moins spécifiques. Comme précédemment, monter dans l’eau pour une observation immédiate, ou dans du lactoglycérol pour une conservation longue.
Références
Le protocole de coloration des endomycorhizes a été développé par C. Grace et D. P. Stribley (1991 : A safer procedure for routine staining of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi, Mycological Research 95, 1160-1162). Le protocole de coloration des ectomycorhizes a été développé par A. Daughtridge, S. Boese, S. Pallardy et H. Garrett (1986 : A rapid staining technique for assessment of ectomycorhizal infection of oak roots, Canadian Journal of Botany 64, 1101-1103).
Alix Helme-Guizon et Marc-André Selosse https://svt-rouen.second-degre.ac-normandie.fr/IMG/pdf/65-helme-selossemyco-1.pdf
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