Glomaline

A15 -Estimation de la richesse en champignons mycorhiziens d'un sol et de sa stabilité face à l'érosion par quantification de la glomaline, glycoprotéine produite par les mycéliums de ces champignons.

version 2 du protocole

Résumé

La glomaline est une glycoprotéine produite dans le sol par les mycéliums des champignons mycorhiziens. Quantifier la présence de glomaline dans un sol permet d'estimer sa richesse en champignons mycorhiziens et sa stabilité face à l'érosion.

Principe

Ce protocole permet de quantifier les protéines du sol lié à la glomaline facilement extractible EE-GRSP (de l'anglais Easy extractable glomalin-related soil proteins). Cette mesure s’effectue en deux étapes. D'abord, la glomaline est extraite par dissolution. Ensuite, elle est quantifiée à l’aide d’un dosage colorimétrique, d'après la méthode BCA (acide bicinchronique). En milieux alcalins, les protéines réduisent Cu2+ en Cu+. Le sel de l’acide bicinchronique est un réactif colorigène hautement spécifique pour le Cu+, qui forme un complexe pourpre ayant une absorption optique maximale à 562 nm. L’absorbance est proportionnelle à la concentration en protéine.

Conditions de mise en œuvre

La mesure s'effectue annuellement, avant la récolte et après avoir réalisé le profil pédologique.

Matériel et fournitures

Matériel

• tamis de maille 2 mm + réservoir

• sachet en plastique hermétique

• balance de précision

• pH mètre de laboratoire

• tubes pour centrifugation de 15 mL + support

• centrifugeuse de 6000 g

• autoclave

• chronomètre

• spectrophotomètre

• cuves spectro de 2,5 mL + support

• albumine de sérum bovin BSA à 2 mg/mL

• 12 tubes à essais + support

Réactifs

• solution d'HCl

• solution de citrate de sodium à 20 mM

• bicinchoninate de sodium

• carbonate de sodium

• sodium tartrate

• hydroxyde de sodium

• bicarbonate de soude

• sulfate de cuivre hydraté

• solution de réactif de travail standard (RTS)

Réalisation du protocole

Préparation de l’échantillon

1) Extraire un échantillon de sol de l’horizon A, à proximité de racines.

2) Retirer manuellement les débris végétaux ainsi que les cailloux (la loupe peut être utilisée) et casser manuellement les agrégats.

3) Tamiser à 2mm l'échantillon frais.

4) Peser 10 g (m frais) dans une plaque de pétri pre-pesée et passer à l’étuve à 105°C pour calculer l’humidité. Peser et noter la masse quand l’échantillon arrive à un poids stable (m sec).

5) Conserver le reste de l’échantillon à 4 °C jusqu'au moment de l’analyse.

Préparation des solutions de travail

• Réactif A : solution composée de 1 g de bicinchoninate de sodium (C20H10N2O4Na2) + 2 g de carbonate de sodium (Na2CO3) + 0,16 g de sodium tartrate (C4H4Na2O6) + 0,4 g d’hydroxyde de sodium (NaOH) + 0,95 g de bicarbonate de soude (NaHCO3), une solution à 10M d’hydroxyde de sodium (NaOH). Remplir jusqu’à 100 mL avec de l’eau déminéralisée et ajuster le pH à 11,25 avec de l’hydroxyde de sodium (NaOH

• Réactif B : solution composée de 0,4 g de sulfate de cuivre hydraté (CuSO4 · 5H2O) dans 10 mL d’eau.

• Réactif de travail standard (RTS). Préparer la solution de réactif de travail standard (RTS) en mélangeant 100 volumes du réactif A avec 2 volumes du réactif B. La solution est de couleur vert pomme et elle est stable pendant 1 semaine à température ambiante.

• Citrate de sodium 20mM: 5,882g de citrate de sodium + 1L d'eau déminéralisée. Ajuster le pH à 7 avec HCl. Conservation à 4°C

Extraction de la glomaline (EE-GRSP)

1) Dans des tubes de centrifugeuse de 15 mL peser 1 g de sol frais (m ech).

2) Ajouter 8 ml de la solution de citrate de sodium (Vcitrate).

3) Placer les tubes 15 mL dans l’autoclave et faire chauffer pendant une demi-heure. Le temps est déclenché lorsque l'autoclave est sous pression à 103 kPa (121°C – 30min). Une fois le temps écoulé, laisser dépressuriser l’appareil avant de récupérer les tubes.

4) De suite après avoir récupéré les tubes de l’autoclave, passer les à la centrifugeuse à 6000g pendant 10 minutes.

Les échantillons doivent être centrifugés rapidement après l’autoclave. Il y a une réduction de la glomaline dans le temps entre le chauffage et la séparation.

5) Le surnageant est enlevé et conservé à 4°C entre 2 à 4 semaines (le surnageant ne doit pas être troublé par un contaminant). Il sera analysé par la suite pour quantifier la glomaline .

Quantification de la glomaline (EE-GRSP)

Recommandation : Afin de limiter le temps d’attente entre la fin de l’incubation des cuvettes (« indication 3 ») et la mesure de l’absorbance (« indication4 »), préparer au maximum une douzaine de cuvettes.

La solution RTS étant valable 7 jours, il est conseillé de réaliser la solution RTS pour analyser l’ensemble des données au cours de la semaine et ainsi n’avoir qu’une courbe étalon à réaliser pour chaque semaine d’analyse.

Courbe étalon

Réaliser une dilution de l’albumine de sérum de bovin (BSA à 2 mg/L) selon une gamme de dilution allant de 0 à 1 mg/L mg/L).

Tube	[BSA] (mg/ml)	Volume de BSA	Volume de citrate
1	1	1 ml de BSA 2mg/ml	1 ml
2	0,5	1 ml de BSA 1mg/ml	1 ml
3	0,25	1 ml de BSA 0,5mg/ml	1 ml
4	0,125	1 ml de BSA 0,25mg/ml	1 ml
5	0,0625	1 ml de BSA 0,125mg/ml	1 ml
6	0	0 ml	1 ml

Les dilutions doivent être réalisées avec la solution de citrate de sodium à 20 mM, à pH=7, afin d’obtenir un volume supérieur à 0,125 mL.

Réaction colorimétrique BCA

Cette procédure doit être faite pour chaque tube de la courbe étalon et pour chaque surnageant des échantillons.

1) Verser 0,125 mL de chaque solution contenant la glomaline ou le sérum de bovin dans des cuvettes de spectro de 2,5 ml. Les cuvettes sont placées sur leur support et elles sont numérotées.

2) Ajouter dans TOUTES les cuvettes 2,5 mL de la solution de réactif de travail standard (RTS). Bien mélanger de sorte à homogénéiser la solution.

3) Incuber toutes les cuvettes à 37 °C pendant 2h

4) Mesurer l’absorbance à 562 nm. La mesure au spectrophotomètre doit être réalisée dans les dix minutes suivant l’incubation. L’absorbance est proportionnelle à la concentration des substances en solution. Mettre le zéro du spectrophotomètre avec la solution de citrate.

Si les valeurs d'absorbance des échantillons sont hors des valeurs de la courbe étalon, diluer les surnageants dans la solution de citrate et re-faire de 1) à 3).

Exploitation des données

Équation de la courbe étalon

Créer un graphique Absorvance vs. CC BSA (mg/ml) et calcular la equation de la courbe par regresion lineal

Abs = α.[BSA] + β

Calcul de concentration de Glomaline (EE-GRSP)

Références

Reyna, D. L., & Wall, L. G. (2014). Revision of two colorimetric methods to quantify glomalin-related compounds in soils subjected to different managements. Biology and fertility of soils, 50(2), 395-400.

Walker, J. M. (2009). The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook, 11-15.

Wright, S. F., & Upadhyaya, A. (1996). Extraction of an abundant and unusual protein from soil and comparison with hyphal protein of arbuscular mycorrhizal fungi. Soil Science, 161(9), 575-586.

Wright, S. F., & Upadhyaya, A. (1998). A survey of soils for aggregate stability and glomalin, a glycoprotein produced by hyphae of arbuscular mycorrhizal fungi. Plant and soil, 198(1), 97-107.

Wright, S. F., & Jawson, L. (2001). A pressure cooker method to extract glomalin from soils. Soil Science Society of America Journal, 65(6), 1734-1735.