FDA hydrolase
A7 - Évaluation de l’activité microbienne par la mesure d’une activité enzymatique à large spectre
Résumé
« Le diacétate de fluorescéine (FDA) est une molécule qui peut être hydrolysée par de nombreuses enzymes dont les estérases, les protéases et les lipases microbiennes. L’hydrolyse de la FDA est donc une activité enzymatique généraliste, avec un spectre d’action beaucoup plus large que d’autres activités enzymatiques spécifiques, comme la phosphatase alcaline par exemple. L’activité FDA hydrolase est déterminée par la mesure de l’absorbance à 490 nm de la fluorescéine libérée par hydrolyse du substrat. » Denis BAIZE guide des analyses en pédologie 3 éd. Chap. 23 p 273
Question posée
Quelle est l’intensité de l’activité microbienne du sol ?
Sources
Le protocole proposé ci-dessous est celui de Green and al. (2006) adapté en fonction du matériel à disposition au Labo Sol Eau. Il existe plusieurs protocoles (cf. § références), dont celui de Adam & Duncan adapté aux faibles niveaux d’activité enzymatique, un protocole complémentaire inspiré de Green proposé par l’université de Neuchâtel pour des litières, un autre proposé par Jusselme pour des petits échantillons. Le protocole Von Siegler est très proche de celui de Adam & Duncan, il propose en outre un protocole adapté aux échantillons liquides. Le protocole d’Agroscope (youtube), assez simplifié, ne cite pas ses sources.
Matériel
Balance analytique
Micro-pipette
Pipette
Seringue 100 ml
Béchers de 100 ml
Tubes à centrifuger 15 ml
Centrifugeuse
Spectrophotomètre et cuvettes
Chambre d'incubation à température contrôlée
Étuve
Réactifs
Acétone
HCl 6N
Eau désionisée
Sodium phosphate buffer pour 1 l (solution tampon)
Dissoudre 22.74 g de Na3HPO4 * 12 H2O (sodium phosphate tribasic) dans 700 ml d’eau désionisée puis ajuster le pH à 7.6 avec de l’HCl. Transférer puis ajuster le tout dans un ballon jaugé de 1litre avec de l’eau désionisée. A conserver au frais (4 °C).
FDA solution mère [4.9 mM]
Dissoudre 20 mg de FDA lipase substrate (C24H16O7 = fluorescein diacetate) dans 10ml d’acétone. A conserver à -20 °C.
Solution pour la courbe étalon de fluorescein
Utiliser une solution mère standard de fluorescein (Fluorescein standard stock solution, 602µM) à 200mg/litre. Dissoudre 10 mg de Fluorescein (C20H12O5) avec 10 ml d’acétone puis jauger à 50 ml avec le sodium phosphate buffer ci-dessus. Préparer ensuite les dilutions suivantes dans des ballons jaugés de 50ml puis compléter au trait de jauge avec le Sodium phosphate buffer. Ajouter finalement 2.5 ml d’acétone.
Procédure
Réaliser la courbe étalon.
Sécher le sol à 40 ° C, le tamiser à 2mm.
Pour le blanc remplacer la prise d’essai par 0,5 ml d’acétone et réaliser la procédure de mesure complète (une solution de contrôle doit être faite pour mesurer la part de la couleur qui n’est pas issue de l’activité enzymatique, ce contrôle permet de définir le blanc lors de la mesure au spectrophotomètre).
Prise d’essai : peser environ 1,0 g de sol et noter la masse m en g.
Mettre la prise d’essai dans un bécher de 100 ml et y ajouter 50 ml de sodium phosphate buffer (pH 7,6).
Ajouter 0,50 ml de FDA solution mère, bien agiter.
Incuber 3 heures à 37°C.
Ajouter 2 ml d’acétone, agiter pour bien mélanger et achever l’hydrolyse.
Transférer 10 ml de la suspension de sol dans un tube à centrifuger de 15 ml.
Centrifuger à 6 000 rpm pendant 5 min.
Transférer le surnageant dans un tube de 15 ml et homogénéiser.
Verser quelques ml de la solution dans une cuvette et mesurer l’absorbance à 490 nm. Si l'absorbance n'est pas comprise dans les valeurs de la gamme étalon (>1), diluer la solution et noter le facteur de dilution.
Expression des résultats
m : masse de la prise d’essai, en g (corrigée par rapport au taux d’humidité à 105 °C)
V : volume de l’extractant en litre, l’extractant est le FDA substrate stock solution: 0.50 ml + buffer 50 ml + acétone 2.5 ml = 0.0525 l
f : facteur de dilution s'il a fallu diluer , sinon f=1
C : concentration en mg de fluorescein /l après report de l’absorbance dans l’équation de la courbe étalon
1000/3 pour exprimer le résultat en µg g-1 h-1
Interprétation des résultats
Références
G Adam, H Duncan (2001) Development of a sensitive and rapid method for the measurement of total microbial activity using fuorescein diacetate (FDA) Soil Biology & Biochemistry 33 (2001) 943-951 VS
Green , DE Stott , M Diack (2006) Assay for fluorescein diacetate hydrolytic activity:Optimization for soil samples - Soil Biology & Biochemistry 38 (2006) 693–701
Jusselme My Dung, (2013) Increased lead availability and enzyme activities in root-adhering soil of Lantana camara during phytoextraction in the presence of earthworms. Science of the Total Environment 445-446 (2013) 101–109
M. A. Sánchez-Monedero & C. Mondini & M. L. Cayuela & A. Roig & M. Contin & M. De Nobili (2008) Fluorescein diacetate hydrolysis, respiration and microbial biomass in freshly amended soils - Biol Fertil Soils (2008) 44:885–890
Univ. NEUCHÂTEL Fluorescein diacetate hydrolysis activity – fiche 36 - 2012
Von Sigler (2004) FDA assay, document texte http://www.eeescience.utoledo.edu/Faculty/Sigler/Von_Sigler/LEPR_Protocols.html
Jusselme My Dung, Dosage Fluoresceine Diacétate (FDA), document texte inédit 2007
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