Procédures

Préparation de la solution indicatrice pour les cuvettes spectrophotométriques

Peser puis insérer dans une fiole jaugée de 1L les réactifs suivants :

- 16.77g de KCl

- 0.315g de NaHCO3

- 0.0187g de rouge de crésol

Dissoudre les réactifs dans 800-900ml d’eau déminéralisée.

Ajuster jusqu’au trait de jauge avec de l’eau déminéralisée et homogénéiser.

Transvaser cette solution indicatrice dans une bouteille en verre et conserver la solution maximum 2 mois à 4°C à l’abri de la lumière.

Préparation les cuvettes spectrophotométriques (préparation pour 60 cuvettes)

Durant cette phase, veiller à être le plus propre possible afin d’éviter les contamination bactériologique et/ou fongique des cuvettes de gel.

Peser et introduire 1.5g d’agar dans un bécher en pyrex (résistant à la chaleur) de 250ml.

Mesurer 50ml d’eau distillée avec une fiole jaugée et les ajouter dans le bécher avec l’agar.

Mettre à chauffer et agiter le bécher contenant l’eau et l’agar sur un agitateur magnétique chauffant avec un barreau aimanté jusqu’à formation de grosses bulles au fond du bécher. Maintenir l’ébullition dans le fond du bécher pendant 1-2 min. La température de la solution doit monter à 90°C minimum (utiliser une sonde de température pour vérifier).

Durant cette étape:

- Ne pas mettre la plaque chauffante à maximum afin d’éviter de faire trop monter en température.

- Eviter les projections de solution d’agar sur les parois du bécher (refroidissement et gélification) afin d’éviter la présence de petits bouts gélifiés dans le gel final qui doit être le plus homogène possible.

Mesurer avec une fiole jaugée 100ml de solution indicatrice, les ajouter petit à petit dans le bécher contenant l’agar en ébullition tout en maintenant l’agitation et la température à 60-65°C.

Durant cette étape :

- Eviter les projections de solution d’agar sur les parois du bécher.

- L’ajout de la solution indicatrice va refroidir la solution d’agar et il faut veiller à ne pas descendre trop en dessous de 60°C.

- L’inertie de la plaque chauffante peut réchauffer la solution à plus de 65°C.

- La solution doit être maintenue à 60-65°C sur la plaque chauffante et continuer d’être agitée pendant les étapes suivantes.

Avec une pipette 0,5 - 5 ml ou avec une seringue de 2ml remplir les cuvettes avec 1.5ml de la solution précédente (mélange de la solution indicatrice avec l’agar chaud) sans laisser de bulles dans les cuvettes ; partir du fond de la cuvette et remonter doucement pour éviter les bulles.

Durant cette étape :

- Réduire et maintenir une agitation lente afin de laisser remonter à la surface les microbulles et ainsi minimiser leur présence dans les cuvettes de gel.

- Il est TRES IMPORTANT de remplir les cuvettes avec exactement la même quantité de solution (1.5ml), sans quoi les mesures SituResp® ne seront pas fiables.

Laisser les cuvettes refroidir pendant 1h environ dans un environnement propre.

Conserver les cuvettes de gel par lot d’environ 15 dans un bocal hermétique de transport propre de 500ml (type « Le Parfait ») contenant environ 10g de soda lime et 2-3 feuilles de papier absorbant mouillé et propre. Placer les bocaux dans le noir complet. La couleur du gel des cuvettes doit progressivement passer de rouge à violet.

Le soda lime capte le CO2 mais réduit l’humidité et il est crucial d’obtenir une atmosphère humide. Il est aussi possible de conserver les cuvettes dans un dessiccateur dans le noir complet avec du soda lime (ou 200 ml de 1M NaOH) et un bécher d’eau.

Ainsi stockées les cuvettes de gel peuvent être conservées plus d’un mois. Surveiller les développements bactériens et fongiques durant la conservation (au besoin changer les chiffons humides).

Il est conseillé de faire plus de cuvette que nécessaire car le tri lors de la confection et les contaminations peuvent amener à en mettre beaucoup de côté.

Vérification des cuvettes avant le terrain

Au minimum 4 jours avant le terrain, lire l’absorbance à 570nm de quelques cuvettes stockées dans chaque pot hermétique.

Il est préférable de réaliser cette étape assez tôt pour avoir le temps de refaire des cuvettes de gel si nécessaire.

Faire le blanc du spectrophotomètre avec un cuvette remplie d’eau déminéralisée.

Lire l’absorbance à 570nm d’une cuvette immédiatement après la sortie du bocal hermétique de transport. .

Les mesure d’absorbance du gel des cuvettes doivent être : 1.7 < Abstest < 1.9

Une absorbance trop faible implique un risque de saturation du gel lors de l’incubation. Une absorbance trop élevée implique un risque de non réponse du gel. Dans l’idéal, les cuvettes de gel utilisées lors d’une campagne de mesure devraient toutes avoir la même absorbance à T0 (±0.05).

Sur le terrain

Les cuvettes avec le gel SituResp® sont transportées dans les bocaux de conservation contenant du Soda lime et un chiffon humide.

Prélever le sol à 0-10cm de profondeur et le tamiser à 5mm.

Peser 100g de sol tamisé et l’introduire dans le flacon hermétique en verre de 250ml.

Faire le blanc du spectrophotomètre avec un cuvette remplie d’eau déminéralisée.

Lire l’absorbance T0 à 570nm d’une cuvette immédiatement après la sortie du bocal hermétique de transport - Noter l’heure de mesure de l’absorbance T0 afin de mesurer l’absorbance à +24h.

Lors des mesures de l’AbsT0 les valeurs doivent être de 1.7 < AbsT0 < 1.9 (voir § vérification des cuvettes avant le terrain)

Mettre la cuvette dans un pot en plastique de 30ml qui permettra de la maintenir et la protégée du sol.

Introduire la cuvette dans le bocal hermétique contenant le sol à l’aide d’une pince.

Fermer hermétiquement et faire attention au transport, les bocaux doivent rester droits pour éviter que le sol ne rentre en contact avec le gel des cuvettes.

L’incubation doit se faire dans des conditions les plus similaire possible pour l’ensemble des mesures réalisées lors de la campagne. En conséquence, sur le terrain, il est conseillé de mettre les pots hermétiques des incubations dans une glacière (sans glace) à l’ombre (à minima de tenir les pots à l’ombre) et de ramener l’ensemble des incubations à l’intérieur pour la nuit. Une température de 20-25°C est idéale. Si nécessaire utiliser un incubateur.

Après 24h, ouvrir et retirer la cuvette du flacon puis lire l’absorbance avec le spectrophotomètre à 570nm (AbsT24) .

Expression des résultats

Après incubation, plus la couleur du gel se rapproche du jaune, plus l’émission de CO2 par le sol est importante.